​ 核酸提取方法对新冠核酸检测结果的影响
2021-10-02 10:34:02

 

 

 

迪飞医学·科普专栏系列

核酸提取方法对新冠核酸检测结果的影响

 

用于 PCR 反应的核酸模板质量是影响新冠核酸检测的重要因素,涉及核酸回收率、纯度、完整性等多个参数。不同核酸提取系统在核酸提取原理(如柱提取法、磁珠提取法、裂解法)、上样量、洗脱体积等方面存在差异,导致 PCR 反应结果差异。目前,市售核酸提取系统种类繁多,其提取效能比较的数据相对缺乏。

 

我们对 AA1A2 型)、 B 两个厂家三种核酸提取仪的核酸提取效果进行了比较。三种核酸提取仪均为开放平台,本实验采用相同的第三方试剂进行提取和扩增(相同的扩增仪)。两个厂家均采用磁珠法提取核酸,操作遵循厂家说明: A 厂家使用 200ul 标本,洗脱液 80ul ,取 5ul 处理后的标本核酸作为 PCR 模板, B 厂家使用 100ul 标本,提取的核酸全部(无洗脱)加入 PCR 反应体系进行扩增,所用 PCR 扩增试剂阳性判断 Ct 值为 40 ,待评估标本分别为室间质评物(高载量)和临床标本(高、低载量)(表 12 )。

 

结果显示,对于高病毒载量的室间质评物, B 厂家较 A 厂家提取的核酸的 N 基因 Ct 值低约 5~6 个循环;同样,对于高病毒载量的临床标本, B 厂家较 A 厂家提取核酸的 N 基因 Ct 值低约 2 个循环; A 厂家两种核酸提取仪( A1A2 )提取核酸 ORF1ab 基因扩增 Ct 值分别为 36.6536.05N 基因扩增 Ct 值相差约 1 个循环,分别为 32.7131.28 (表 5 )。室间质评物和临床标本经 AB 两个厂家提取仪提取的核酸 Ct 值差值 存在差异( N 基因: 56 VS. 2 ),可能因质评物靶样构成(为噬菌体病毒样颗粒)和基质成分与临床标本不同,具体原因有待进一步研究。

 

此外,我们于 2020314 日留取 21 例新冠住院患者咽拭子标本(入院时新冠核酸阳性,此次采样送检目的为住院期间病毒监测,病毒核酸阳性与否及病毒载量高低不确定)和 42 例非新冠病人咽拭子标本用于比较两个厂家核酸提取仪的核酸提取效果,结果发现:

 

在新冠患者中, A 厂家提取仪提取核酸的阳性检出率为 38.10%8/21 ),高于 B 厂家提取仪( 28.57%[6/21] )( AB 产品均阳性 4 例, AB4 例, AB2 例) , 差异有统计学意义( P0.05 ),检出阳性标本 N 基因 Ct 值位于 3640 之间,为低病毒载量。余 11 例标本( PJ9-PJ21 )经 A 厂家提取仪提取核酸检测 N 基因或 ORF1ab 基因有特异性 PCR 扩增曲线(无 Ct 值或 Ct 值> 40 ),而 B 厂家提取仪提取核酸无扩增曲线(表 6 )。 42 例非新冠病人标本经两个厂家三种仪器提取核酸均未检出阳性结果,亦无扩增曲线(结果未展示)。

 

两个厂家仪器对低病毒载量标本 提取效果不一致 的原因可能为: B 厂家仪器提取的核酸不纯,或含有 PCR 干扰物质(未洗脱,含磁珠),对低病毒载量标本 PCR 扩增反应具有更强的抑制作用,进而出现假阴性结果。

 

值得注意的是, 采用临床标本进行评估时, N 基因的 Ct 值明显低于 ORF1ab 基因 ,这可能是由于 ORF1abN 基因之间的相对扩增差异,因为 N 基因的亚基因组 mRNA 水平相对 ORF1ab 基因高得多 [1]

 

上述结果显示, 不同厂家的核酸提取仪提取效果存在差异 。因此,在新的核酸提取仪应用于临床实践之前应评估其核酸提取效果。另外,用于评估的标本除定值标准品之外,还应包含高、低病毒载量的临床标本。

 

参考文献:

1.Moreno, J.L., et al., Identification of a coronavirus transcription enhancer. J Virol , 2008. 82(8): p. 3882-93.

 

来源:检验医学