​ 人呼吸道病毒感染检测进展
2021-09-21 10:34:02

 

 

 

迪飞医学·科普专栏系列

人呼吸道病毒感染检测进展

 

 

呼吸道病毒感染是世界范围内人类最常见的疾病之一,而由新发病毒引起的呼吸道病毒感染是全球公共卫生的巨大威胁,如最近在中国武汉爆发的肺炎疫情的元凶 -- 新型冠状病毒 2019-nCoV 。鉴定呼吸道病毒感染的病原体对于选择合适的治疗方法、挽救生命、控制疫情、避免不必要的抗生素使用具有重要意义。传统的诊断方法,如快速检测抗病毒抗体或病毒抗原的方法,在临床实验室中得到广泛应用。随着现代技术的发展,新的诊断策略,包括多重核酸扩增和微阵列分析,正在逐步成熟。本文综述了流感病毒、人呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virusRSV) 、冠状病毒、人腺病毒 (human adenovirushAdV) 、人鼻病毒 (human rhinovirushRV) 等常见呼吸道病毒的当前成熟可用及新的检测方法。还描述了多重测定法用于同时检测多种呼吸道病毒感染。这些数据将有助于研究人员和临床医生制定适当的诊断策略,以便及时、有效地检测呼吸道病毒感染。


1.
引言

急性呼吸系统疾病 (Acute respiratory disease, ARD) 在全世界所有急性疾病的发病率和死亡率中占很大比例,其中急性病毒性呼吸道感染是主要原因 ( 约占 80%) 。主要的病毒性病原体有流感病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、腺病毒、鼻病毒。在五岁以下儿童中,仅流感和呼吸道合胞病毒的全球总死亡率每年就达到 30 万人。其他两种呼吸道病毒,如腺病毒和鼻病毒,虽然死亡率较低,但发病率很高,造成巨大的经济负担。严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV) 、中东呼吸综合征冠状病毒 (MERS-CoV) 等高致病性的新发和再发冠状病毒的爆发或大爆发对全球公共卫生构成重大威胁。最近,一种新型冠状病毒 2019-nCoV (https://www.who.int) 已导致 41 例确诊患者肺炎,其中 7 例病情严重, 1 例死亡, 2 例康复 (https://www.shine.cn/news/nation/2001119576/) 。该冠状病毒的完整基因组序列于 2020110 日公布。其中与 sars 样冠状病毒和蝙蝠 sars 样冠状病毒的同源性在 82% 以上。

准确、快速地诊断病毒性病原体对选择合适的治疗方法、挽救生命、控制疫情、减少抗生素的不必要使用具有重要意义。以上提到的所有病毒都可能导致上呼吸道和下呼吸道感染,以及临床表现叠加,这使得医生在没有可靠的实验室分析的情况下很难区分病原体。传统的诊断方法,如病毒培养和直接 / 间接免疫荧光测定法 (IFA) ,既耗时又费力,灵敏度有限。快速准确地诊断呼吸道病毒有助于流行病学监测,并采取有效的预防措施和实施适当的抗病毒治疗。在过去的几十年,病毒诊断测试已经从传统方法发展到快速抗原检测。最近发展了高灵敏度的核酸扩增检测 (nucleic acid amplification testsNAAT) 和床旁诊断 (point-of-care testsPOCT)

在这篇综述中,我们叙述了目前可用或正在开发的用于诊断人类常见呼吸道病毒感染的各种方法。预计这些数据将有助于临床实验室快速、准确地诊断呼吸道病毒,从而为医生及时、适当地治疗患者提供必要的信息。

 

2. 流感病毒及其诊断方法

流感病毒属于正粘病毒科。该科由五个属组成,根据内部核蛋白 (NP) 和基质 (M) 蛋白进行分类,包括 A 型流感病毒、 B 型流感病毒、 C 型流感病毒、托高土病毒属( Thogotovirus )和 Isavirus 。在这 5 属病毒中,只有 A 型流感和 B 型流感病毒引起临床疾病。 A 型流感病毒是人类感染的主要病原体,因此也是大规模流感流行和大流行的主要原因,而 B 型流感病毒感染通常引起局部暴发。根据病毒表面的糖蛋白血凝素 (HA) 和神经氨酸苷酶 (NA) 的差异,甲型流感病毒被分为大量不同的亚型。到目前为止,已经鉴定出 18HA (H1-H18)11NA (N1-N11) 亚型。许多诊断方法,包括病毒分离以及一些新的分子诊断的方法,已用于临床实验室中流感病毒的检测。

 

2.1 传统的流感病毒检测方法

病毒培养是诊断流感病毒感染的金标准。这种方法包括用临床样本接种于相应的细胞株,如 Madin Darby 犬肾 (MDCK), A549, 和恒河猴肾 (LLC MK2) 细胞,增殖 710 天监测细胞病变效应 (CPE) ,最后通过红细胞吸附或用特定的抗体染色或免疫荧光显微镜确认流感病毒感染。 IFA20 世纪 60 年代开始使用。它直接用荧光标记的流感病毒特异性抗体染色来源于鼻咽吸液或拭子的呼吸道上皮细胞。目前,一些 FDA 批准的酶联免疫吸附试验 (ELISA) 可用于流感病毒感染的诊断。然而,与核酸检测相比, ELISA 法的敏感度一般较低。目前,已经出现一种新型的基于铕纳米颗粒的免疫分析方法,具有较高的敏感性和特异性,可快速检测 29 株甲型流感病毒和 10 株乙型流感病毒。

 

2.2 基于分子诊断技术的流感病毒检测方法

上述常规诊断方法的敏感性和特异性普遍低于分子方法。随着实验室病毒诊断方法的发展,从分泌物样本中分离病毒病原体比以前容易得多。

快速流感诊断试验 (RIDT) 为检测甲型和乙型流感病毒提供了一种更快的方法。然而其在识别流感病毒亚型方面能力有限。此外,它的测试性能 ( 如敏感性和特异性 ) 差异很大。例如,在 200911 月,使用直接抗原 EZ Flu A+B kit 分析了 290 名疑似流感患者。 RIDT 的敏感性和特异性分别为 40.5%94.5% 。基于聚合酶链反应 (PCR)NAAT 检测方法检测的是病毒特异性遗传物质,而不是病毒抗原或抗体。因此,需要对病毒遗传物质进行最优提取。 NAAT 相对于 RIDT 的优点之一是 NAAT 能够识别不同的流感病毒亚型。 Trombetta 研究小组发现, NAAT 对甲型流感和乙型流感病毒都具有更高的敏感性,尽管它的特异性相对较低。各种 NAAT 检测方法,如逆转录聚合酶链式反应 (reverse transcriptase-PCR) 、环介导的等温扩增法 (loop-mediated isothermal amplification-based assay, LAMP)DNA 微阵列法 (DNA-microarray-based tests) 和测序法 (sequencon -based tests) 等,都应用于人类流感病毒感染的诊断中。 Poon 研究组应用临床的季节性甲型 H1N1 流感和 H3N2 病毒的样本检验 LAMP 方法,发现其检测灵敏度为 100% ,分析灵敏度为 10Copies/Test 。与 RT- PCR 法相比,实时 RT-LAMP 法对 2009H1N1 大流行病毒样本的检测敏感性为 97.8% ,特异性为 100%11LAMP 法也用于检测高致病性 H5N1H7N9 禽流感病毒,其敏感性与 RT-PCR 法相当或更高。然而, NAAT 的高成本,需要复杂设备,以及训练有素的专业人员,使得 NAAT 检测在资源有限的地区不太实用。

此外,还开发了基于 DNA 微阵列的方法来检测流感病毒,为准确和快速诊断流感爆发或大爆发提供了一种新的工具。该法采用多重寡核苷酸探针特异性针对甲型和乙型流感病毒 HANAM 蛋白的保守序列。例如,赵的研究小组已经开发了一种基于金纳米颗粒的基因组微阵列分析方法,能够将 H5N1 病毒与主要的季节性甲型流感病毒 (H1N1, H3N2) 区分开来。由于其寡核苷酸探针的设计是根据 H5N1 病毒 HANA 基因以及 H1N1H3N2H5N1 病毒 M 基因的一致序列设计的。该小组并为 2009H1N1 大爆发病毒的 HANAM 基因设计了特定的寡核苷酸,从而能够检测出 2009H1N1 大爆发病毒并将其与其他甲型流感病毒区分开来。

特别是最近报道使用纳米微阵列筛选和多重下一代测序 (NGS) 分析形成的一个组合诊断平台可以同时在单一样本中识别和区分 A 型流感和 B 型流感病毒。最近,利用 MinION 便携式测序仪开发了一种高通量全基因组测序 (WGS) 方法来检测甲型和乙型流感病毒,随后通过 Illumina MiSeq 平台进行了验证。两个平台总的 1D Read 的准确率、精密度和回收率分别为 99.95%97.88%89.41%Vs 99.97%99.86%93.28%

3. 人呼吸道合胞病毒及其诊断方法

人类 RSV 是副粘病毒科的一种无节段负义单链 RNA 病毒。 RSV 的基因组包括 10 个基因共编码 11 种蛋白质。根据基因组序列和单克隆抗体 (mAbs) 对表面糖蛋白 (G) 和融合蛋白 (F) 的反应活性, RSV 可分为 AB 亚群。 RSV 是免疫缺陷人群 ( 如婴幼儿和老年人 ) 严重呼吸道疾病的主要致病因子之一,在世界范围内发病率和死亡率都很高。早期和准确的诊断 RSV 对合适的治疗至关重要。

 

3.1 传统的呼吸道合胞病毒检测方法

ELISA 法和免疫荧光法是传统的 RSV 检测方法。一种低成本的改良 ELISA 方法已经被开发出来,其检测 RSV F 蛋白,可以在 25 分钟内检测出 RSV 。免疫荧光法可以使用荧光标记的一抗或二抗快速检测 RSV 抗原。例如,直接荧光抗体法 (direct fluorescent antibody assay, DFA) 要求标本中有一定数量的细胞,其灵敏度和特异度分别为 94%96.8% ,因其简便、快速而被临床实验室广泛用于 RSV 的检测。由于这个原因,这种化验方法在资源有限的国家特别有用,因为它可消除长期住院和避免抗生素滥用。

半导体量子点由于其独特的尺寸依赖的光学和电子特性,可用于生物和生物医学领域。该方法使用巯基乙酸盐 (TGA) 包被碲化镉 (CdTe) 微粒, CdTe 微粒与抗 RSV F 蛋白 mAb 偶联,检测 RSV F 蛋白。它克服了 DFA 法的背景染色,荧光染料快速漂白等缺点,从而大幅提高灵敏度。本方法甚至比 RT-PCT 方法更灵敏。通过 QDs 检测 F 蛋白和 G 蛋白,共聚焦显微镜可以检测到 HEp-2 细胞系 RSV 感染的进展,发现该方法比 rt - pcr 更敏感

另一种快速 RSV 检测方法是 ) 基于免疫层析技术的侧流免疫分析法 (Lateral flow immunoassayLFIA ,使用的是鼻腔洗液或分泌物样本。目前市场上有许多 LFIA 试剂盒,如 BD Directigen EZ RSVBinax now RSVRSV Respi-StripRemel XpectQuickLab RSV test 等。上述试剂盒的敏感性和特异性通常高于 90%95% ,但不同制造商之间有差异。

 

3.2 基于 PCR 技术的人呼吸道合胞体病毒检测方法

PCR 方法以巢式 RT-PCR 技术为基础,利用 RSV-A-BF 基因设计外引物和内引物。该方法已在成人感染的诊断中得到应用。它可以用于检测低病毒滴度的样品,并敏感地鉴定使用基于抗原的检测方法。

通过对传统 PCR 方法的改进,建立了以下新的 PCR 检测方法。如实时定量 PCR (RT-qPCR) 是一种快速、特异、灵敏的 TaqMan 探针 PCR 法,用于检测、分组和定量 RSV 病原体。它提高了常规 PCR 的灵敏度。该方法需要两套引物 - 探针对,分别是来自核衣壳 (N) 基因的核苷酸序列或针对 RSV-ARSV-B 的融合 (F) 基因。采用定量 TaqMan PCR 检测香港 175 例有呼吸道症状儿童的鼻咽分泌物,共检出 36RSV 阳性样本,其中 10 例为 RSV-A, 26 例为 RSV-B 。相比之下,基于细胞培养的分析只鉴定出 21RSV 阳性标本,免疫荧光分析鉴定出 32RSV 阳性标本,这些标本 TaqMan PCR 检测结果均为阳性,表明 TaqMan PCR 检测具有更高的准确性和敏感性。此外 , 锁核酸 (locked nucleic acidLNA) 单管巢式实时 PCR 技术 (one-tube nested real-time PCR OTNRT-PCR) 是一个超高的灵敏度和低的交叉污染的 RSV 检测方法。共有 143RT-qPCR 法检测为 RSV- 阴性的鼻咽分泌物样本用 OTNRT-PCR 产品确认为 RSV- 阳性,这表明 OTNRT-PCR 法比 RT-qPCR 法更敏感。此外,快速反转录重组酶辅助扩增法 (reverse-transcription recombinase-aided amplificationRT-RAA) 被发展成为一种基于分子诊断的方法来检测临床标本中 RSV AB 亚群。该方法主要利用酶混合物,内含有单链 DNA 结合蛋白 (single-strand DNA binding protein, SSB) 、重组酶 UvsXDNA 聚合酶,来检测 RNA 扩增子。它是在 39 ° C 条件下, 30 分钟内,高特异性完成扩增。此外,逆转录链侵入扩增法 (reverse transcription strand invasion-based amplificationRT-SIBA)RSV 的逆转录等温核酸扩增快速检测法,具有良好的敏感性,它可以在 20 min 内检测只有 10 拷贝的 RSV RNART-SIBA 法检测 RSV 时不需要高纯度 RNA ,可以减少样品制备的复杂性和缩短总的临床标本检测周期。

4.   冠状病毒及其诊断方法

冠状病毒属于冠状病毒科。蝙蝠被认为是各种冠状病毒的天然宿主库和载体,这些冠状病毒跨越物种屏障感染人类和许多其他不同种类的动物,包括鸟类、啮齿动物和翼手类动物。冠状病毒可引起呼吸道和神经系统疾病。到目前为止,已经确定了 6 种人类冠状病毒 (HCoVs) ,包括 HCoV-229EHCoV-HKU1HCoV-OC43HCoV-NL63 、严重急性呼吸综合征冠状病毒 (SARS-CoV) 和中东呼吸综合征冠状病毒 (MERS-CoV)MERS-CoV20126 月首次报道的一种人类冠状病毒,可导致人类呼吸道疾病。 MERS-CoV 归类为 C β - 冠状病毒家族,其包括一个大约 30 kb 的正义单链 RNA 基因组 , 它与扁颅蝠属 Tylonycteris 蝙蝠的冠状病毒 CoV HKU4 株和伏翼属 Pipistrellus 蝙蝠冠状病毒 CoV HKU5 株的 C β - 冠状病毒家族密切相关。人类 MERS-CoV 与骆驼来源的冠状病毒的核苷酸序列的同源性 > 99.5% ,这表明人和骆驼属于同一种冠状病毒。截至 2019930 日,已向世卫组织报告 2468 例经实验室确诊的 MERS-CoV 感染病例,其中包括 27 个国家的 851 例死亡 (https://www.who.int/cies/mers-cov/en/) 。由于目前还没有针对 MERS 的商业疫苗或治疗方法,因此对 MERS-CoV 的快速准确诊断对预防其传播和暴发具有重要意义。

目前对冠状病毒的诊断方法包括 RT-PCR 、实时逆转录 PCR (real-time reverse transcription PCR, rRT-PCR) 、逆转录环介导的等温扩增 (reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP) 和实时 RT-LAMP 法等。

一种引物和探针对保守的 SARS-CoVMERS-CoV 刺突担保 S2 基因的双重 RT-PCR 的方法被建立。以 pUC57SARS-pS2 做为 SARS-CoV 的模板,以 pGEM-MERSS2 做为 MERS-CoV 模板进行检测,检测限为 50-100 拷贝 /mL 。采用单位点 RT-iiPCR 法分别检测 MERS-CoV 包膜基因 (upE) 和开放阅读框 1a (ORF1a) 基因。与参照的单位点 RT-qPCR 方法相比,单位点 MERS-CoV ORF1aupE RT-iiPCR 方法的灵敏度分别为 99.03% 100%

现有 6 个基于 rRT-PCR 的商用 MERS-CoV RNA 检测试剂盒,包括 AccuPower (Bioneer ,韩国 )Anyplex (Seegene ,韩国 )DiaPlexQ (SolGent ,韩国 )LightMix (Roche Molecular Diagnostics ,瑞士 )UltraFast (Nanobiosys ,韩国 )PowerChek (Kogene Biotech ,韩国 )PowerChek MERS Real-time PCRAnyplex II MERS- CoV (upE) 实时检测试剂盒和 DiaPlexQ MERS 病毒检测试剂盒由两个步骤组成。第一步以 upE 基因上游区域为筛选对象,第二步以 upEORF1a 的多个基因区域同时检测为最终确诊。 AccuPower MERS-CoV Real Time RT-PCRLightMix Molecular Dx MERS-CoV upE/ORF1aUltraFast LabChip MERSCoV Real- Time PCR 试剂盒使用两种靶向 upEORF1a 基因的单基因试剂同时检测这两个基因。与其他呼吸道病毒未见交叉反应。根据 28 个特异性盘和 9 个临床标本的验证试验,所有这些 rRT-PCR 试剂盒检测 upEORF1a 的灵敏度和特异性分别达到 100%(95% 置信区间 (CI): 0.60-1.00)100%(95% 置信区间 :0.79-1.00) 。根据高抑制性盘的结果, AccuPowerPowerChekPCR 的抑制具有最低的敏感性。因此,上述 6rRT-PCR 试剂盒的总体敏感性和特异性可以有效诊断 MERS-CoV 感染。

RT-LAMP 实验中,采用了两组引物,一组针对 N 基因,一组针对 ORF1a 基因。这两套引物在扩增来自不同 MERS-CoV 毒株的目标序列方面都具有很高的效率,并且与其他呼吸道病毒没有交叉反应。 Huang 课题组结合 RT-LAMP 技术和垂直流动显示带技术 (a vertical flow visualization stripRT-LAMP-VF) ,建立了核酸可视化技术,用于检测 MERS-CoVN 基因。 RT-LAMP-VF 分析可以检测到 2 × 101 拷贝 / μ l 的合成 RNA1 × 101 拷贝 / μ l MERS-CoV RNA ,与多个 SARS 相关冠状病毒包括 HKU1HKU4OC43229E 没有交叉反应,从而表现出高特异性。

上述涉及的 RT-LAMPRT-LAMP- VF 技术是快速准确检测 MERS-CoV 感染的检测方法。 Bonhan Kooa 团队设计了一个拱形的多目标传感器,可以直接扩增临床样本中 RNA ,快速识别病原体。该方法可检测包括 MERS-CoV 在内的多种病毒,具有较高的敏感性和特异性,能够在 20 分钟内从临床样本中区分出 MERS-CoVHCoV 。基于 TaqMan 探针技术的一步法 rRT-PCR 检测方法通过检测 upE 和开放阅读框 (ORF) 1b 基因,对 MERS-CoV 提供快速、灵敏的内部诊断检测。该方法可靠、特异强、重现性良好。另外,与传统的两步样品检测方法不同,一步法将两个步骤合并为一步,从而增加了测量的灵敏度,例如针对 upEORF1b 基因的灵敏度分别可达 <10 拷贝 / 反应和≦ 50 拷贝 / 反应。基于 NP 单克隆抗体的 MERS-CoV 快速检测方法因其特异性高、敏感性中等而被用于 MERS-CoV 感染的初步快速筛查。本法检测 MERS-CoV 的检测限约为 103.7-104.2 TCID50/ml ,灵敏度约为抗原捕获 ELISA 法的 25- 100

5.   人腺病毒及其诊断方法

腺病毒 (AdV) 感染现在被认为是构成人类或动物发病率和死亡率的一个重要因素。人腺病毒 (hAdV) 感染易于传播,可感染所有年龄组,特别是婴幼儿和老年人,以及免疫缺陷和器官移植患者。 hAdV 为无包膜球形结构,直径 70~100nm 。外壳由 252 个衣壳蛋白组成,包括 240 个六邻体和 12 个五邻体,由它们组成二十面体病毒衣壳。衣壳表面由 20 个三角形构成,使外壳形成 30 条边和 12 个顶点。 hAdV 的基因组以线性双链 DNA 的形式存在于衣壳中,其大小从 34 kb 到超过 37 kb 。基因组包含了与 hAdV 复制相关的早期表达基因 E1 ~ E4 ,中间基因Ⅸ和Ⅳ a2 、和与成熟的病毒粒子的生产相关的晚期区域基因 L1 ~ L5HAdV 属腺病毒科,根据衣壳蛋白六邻体和纤维蛋白特性、相对的核酸同源性、免疫化学反应、生物学特性和系统发育关系,共分为 7(A ~ G) 种,有 50 余种血清型。这种细分具有一定的临床意义,本质上是因为不同的 hAdVs 在组织定位和疾病类型上存在差异。 HAdV 可引起多种疾病,如呼吸道疾病 (HAdV -B-C-E) 、胃肠炎 (HAdV -F-G) 、角膜结膜炎 (HAdV -B-D) 、脑膜脑炎 (HAdV - A-B-D) 。因此,在 hAdV 进展之前对其进行有效、快速的诊断,将为有效监测 hAdV 感染提供依据,并为及时、有效地治疗 hAdV 相关疾病提供保障。

 

5.1 人腺病毒的传统检测方法

细胞培养后腺病毒的分离及其免疫学检测方法通常被认为是诊断的“金标准”。从病人身上采集的样本,如喉部拭子和粪便样本,经抗生素过夜处理、离心、用上清液接种于敏感细胞 (Hep-2Graham 293A549) 。经 37 ℃孵育后观察 CPE ,分离出 hAdVhAdV 的血清型的确定是通过血凝抑制试验 (HI) 检测五邻体蛋白的抗原决定簇。 HAdV 也可以通过中和试验 (NT) 检测六邻体蛋白的抗原决定簇来进行分型。但这些方法耗时长,需要有经验的技术人员对结果进行分析,结果具有不确定性。不同类型的 hAdV 感染可引起不同的疾病和不同的症状;因此,抗原和抗体的检测可以使 hAdV 感染的诊断更加迅速和灵敏。间接 ELISA 法可检测人血清或血浆中 hAdVIgAIgMIgG 抗体。免疫荧光 (IF) 、乳胶凝集试验 (LAT) 和酶免疫分析 (EIA) 也是临床实验室普遍采用的诊断方法,因为它们具有简单、快速的特点。

 

5.2 基于分子诊断的人腺病毒检测方法

在许多实验室和临床中,新兴的分子检测方法逐渐取代了传统的检测技术,为 hAdV. 的诊断提供了可靠的新方法。

hAdV 六邻体蛋白表面的特异性抗原决定簇可以用中和抗体确定。六邻体蛋白的抗原决定簇有 L1L2 两个环,它们被分成七个高变区 (HVR) ,其中 HVR 1-7 已经成为腺病毒分型选择的最新方法。 Madisch 开发了一种两步诊断方法,通过扩增和测序 L1L2 基因可以有效分类 51 种血清型。 Shimada 研究更为保守的 HVR 六邻体基因 , 可以分析 44 个血清型 , 但它仅限于导致角膜结膜炎的 hAdV 血清型。实时荧光定量 PCR 技术是诊断 hAdV 感染的敏感定量技术。利用对六邻体基因保守区设计的引物引物和探针进行 51 种血清型的检测。本法灵敏度 <=15 拷贝 / 反应,定量线性范围为 1.5x101 ~ 1.5x108 拷贝 / 反应。 The RealStar ® Adenovirus PCR Kit 1.0 是用于体外检测和定量的 hAdV 特异性 DNA 的实时 PCR 诊断试剂。其灵敏度 1.09 拷贝 / μ l(95%: 0.62 - 3.08 拷贝 / μ l) ,它与 35 种人类病毒病原体没有交叉反应。与 The RealStar ® Adenovirus PCR Kit 相比,内部 in-house qPCR 可用于定性和定量检测 hAdV 特异性 DNA ,并且检测更灵敏、可靠。以 the RealStar ® Adenovirus PCR Kit 为参照,用 122 个临床样本和 18 个已知样本,对该内部 in-house qPCR 的性能特征进行了评估。在这项研究中,内部 hAdV qPCR 化验检测到 6 种类型的 hAdVA~F ,除了 G 种。以 The RealStar ® Adenovirus PCR Kit 为参照,内部 in-house qPCR 的敏感性和特异性分别为 98.1%100% ,两者的相关性分析很好 (R2 = 0.984) 。此外,内部 in-house qPCR 检测的线性范围可达 9 log10 拷贝 /mL ,而且变异系数值表明,其内部 / 外部检测之间的差异非常小。

6.   鼻病毒及其诊断方法

鼻病毒 (RhinovirusesRVs) 是属于小核糖核酸病毒科肠病毒属的 RNA 病毒,分为 3(AC) 160 多种血清型。 RVs 是具有二十面体对称衣壳的小单链 RNA 病毒。 RVs 是儿童和成人呼吸道感染最常见的病因。 RV- ARV-C 是常见的 RV 种类,可引起下呼吸道疾病,喘息和急性哮喘,在儿童中可导致比 RV- B 更严重的症状。

病毒培养分离与酸稳定试验相结合是诊断 RV 的经典方法。但该方法耗时、费力,限制了其临床应用价值。人 RV 抗体可通过免疫方法检测,如补体固定试验 (complement fixation testCFT)HI 试验、 IFELISA 等。然而,由于缺乏合适的交叉反应抗原来覆盖大量的 RV 血清型,这些方法的应用受到极大的限制。相比之下,一步法实时 PCR 检测是通过核酸序列检测系统来检测 RVs 的。本实验改进了工作流程,缩短了准备时间,消除了 cDNA 从逆转录反应管转移到 PCR 反应步骤过程中可能出现的交叉污染。半巢式 RT-PCR 检测是基于极为灵敏的 PCR 技术检测空气传播的 RVs ,其检测限 (LOD) 约为 0.8 TCID50 。一步法 Panenterhino/Ge/08 实时 RT-RCR 测定方法已开发成功,并通过使用内提取对照和体外转录的鼻病毒 RNA 连续稀释的方法进行了验证。本试验的 LOD 和定量检测限 (LOQ) 分别为 3.10 log copies/ml4.10 log copies/ml ,其分析内重现性 r2=0.999 。随着全基因组测序 (WGS) 技术的快速发展,越来越多的实验室可以在临床上对人 RV 分离株进行 WGS 检测。随着 hRV- C 的发现,全基因组 hRV 测序的数据量得到了显著提高和改善。这将有助于研究人员和临床医生理解 RV 的进化和重组,这有助于 RVs 的诊断。

7.   多种呼吸道病毒检测

虽然能够在有症状的患者中检测到单一呼吸道病毒,但其他呼吸道病毒也可能同时存在。儿童,尤其是五岁以下的儿童,出现合并感染的频率更高。在一个管中包含多个病毒基因靶点的多重检测法具有同时快速检测几种潜在病毒病原体的优点。多重实时 PCR 可以在短时间内同时检测多种呼吸道病毒。与单基因检测方法相比,多重检测方法具有更高的样本输出量 ( 每次运行 96 个样本 ) 、更短的运行时间 (5h) 和更少量的样本需求

The Luminex NxTAG Respiratory Pathogen Panel (NxTAG-RPP) 是由 the xTAG Respiratory Viral Panel Fastv2 (RVPv2) 检测技术升级而来的一种新型高通量多重实时 PCR 检测系统。本试剂对多种呼吸道病原体的检测具有良好的诊断效果。共检测了包括 hAdVRV 在内的 284 例临床呼吸道标本和 3A/H7N9 流感病毒培养标本, NxTAG-RPP 的整体诊断敏感性为 98.9% (95% CI: 97.2 ~ 99.7) ,特异性为 99.0% (95% CI: 98.6 ~ 99.2) 。本实验对 hAdV 的检测灵敏度为 100% 。已经发展了若干这类检测试剂,并在表 2 中摘要说明。

 

 

近年来, Feng 等人设计了锁核酸 LNA 修饰引物,并开发了一种单管多重巢式实时 RT-PCR (multiplex one-tube nested real-time RT-PCRmOTNRT-PCR) 检测方法,可以同时检测 RSVhRV 和人变性肺病毒 (human metapneumovirushMPV) ,相对于单独的 RT-qPCR 具有更高的灵敏度和更低的成本。本技术用 398 个临床样本进行评价,对 RSVhRVhMPV 的敏感性为 5 拷贝 / 反应。与其他常见呼吸道病毒无交叉反应,本实验检测 96 例样本的总时间为 2.7 h

Panther Fusion ® 呼吸道检测试剂已被开发用于检测多种呼吸道病毒,它由三个多重实时 PCR 盘组成 :Flu A/B/RSVParaflu( 副流感病毒 )hAdV/hMPV/RV 。本实验检测流感 A/BRSVParaflu 1-3hMPVRVhAdV 的性能特征已经使用 395 个鼻咽 (NP) 标本和 104 个下呼吸道 (LRT) 标本进行了评估。采用 Wilson-126 评分法计算 95% 置信区间阳性一致性 (positive percent agreementPPA) ,和间阴性一致性 (negative percent agreementNPA) 。对于 NP 样品, Panther 融合实验对所有靶细胞均有 100% PPA98.4~100% NPA 。在 LRT 样品中,除 hMPV(96.1%) 外,所有靶区均为 100% PPA ,所有靶区均为 100% NPA   FTD21 试剂盒 (fast track Diagnostics Respiratory 21, FTD21 kit) 是一种商业化的多重核酸扩增试剂盒。 FTD21 试剂盒使用流感样疾病患者的 665 个样本进行了评估。与 RealStar 1.0 试剂盒相比,该试剂盒的敏感性为 90.7% ,特异性为 100% 。此外,改进后的 FTD21 试剂盒后,灵敏度提高到 97.3%

GeXP 的多重 RT-PCR 方法被开发,它同时检测 16 种不同呼吸道病毒。设计了 17 组嵌合引物启动 RT-PCR ,并在后续的 RT-PCR 循环中使用了另外一对通用引物。 GeXP 法对单个病毒的敏感性为 20-200 拷贝,当 16 个预混的病毒靶点全部存在时,敏感性为 1000 拷贝,表明该方法是一种灵敏、特异的呼吸道病毒检测方法。

Qiagen ResPlex II V2.0 kit 使用靶向富集 RT-PCR 扩增结合悬浮阵列,可以检测到共 17 种呼吸道病毒 , 包括流感 A / BPIV 1/2/3/4RSVhMPV ,鼻病毒 (RVs) ,肠道病毒 (EV) ,人类博卡病毒 (hBoV) hAdV 4 种冠状病毒 (229 E, OC43NL63HKU1)FluA pdm09 。从 438 年鼻咽拭子标本验证,其特异性为 92.9~100% 。对 PIV3hMPVPIV1BoV 的敏感性分别为 73.1%70%66.7%55.6% ,但是对 FluAEnVOC43RSVH1N1 的敏感性较低。

FilmArray ® 多重 PCR 系统是一个多重 PCR 盘,可用于检测 17 种病毒,包括 RSV-ARSV-B ,以及 2 种细菌。这个平台需要 2 分钟的样品准备时间和大约 1 小时的设备运行时间。检测平台集细胞裂解试剂、 DNA/RNA 提取试剂、纯化试剂、扩增试剂、检测试剂于一体。运行结束后,进行软件分析,并在一个完整的表中显示测试结果,其中包括所有检测的病原体。研究表明,与 eSensor ® xTAG ® 和实验室开发的检测相比, RSV-A 的敏感性为 86.4%RSV-B 的敏感性为 100%RSV-ARSV-B 的特异性为 100% 。与 Prodesse ® 试剂相比,敏感性和特异性分别为 100%99.5%

8.   结论

呼吸道病毒是全世界所有年龄组出现呼吸道感染症状的主要原因。及时和准确地诊断这些病毒的感染使临床治疗能采取适当的手段。本文综述了传统的和现代的分子诊断方法的原理及其优缺点,并对几种常见的呼吸道病毒如流感病毒、人类 RSV 、冠状病毒、 hAdV 和鼻病毒的检测技术进行了综述。然而,这些呼吸道病毒容易因病毒基因点突变而导致抗原漂移,而具有大流行潜力的新毒株可能是基因重组的结果。所有这些都对快速准确地检测人类呼吸道病毒感染提出新的挑战。因此,识别病毒基因组内的突变是非常必要的。然而,查明人类呼吸道病毒基因突变的工作依赖于使用 Sanger 测序的单基因或基因家族的高通量测序。尽管这一方法已经取得了丰硕的成果,但 Sanger 测序的成本和通量常会阻碍构成人外显子组的约 22000 个基因的系统测序。 NGS 技术的最新发展改变了这一范式,它以相对较低的成本提供了快速外显子、转录组和基因组的测序能力。 NGS 在呼吸系统病原菌的诊断和鉴定中的应用越来越广泛,特别是对重症肺炎患者和不明原因感染患者。 NGS 在重症肺炎患者中具有检测共感染病原体的能力,在重症肺炎的诊断中较常规方法有较好的表现。作为一种罕见的环状基因型,病毒株全基因组的基因组特征将促进对其流行病学和致病性的进一步研究,并有助于诊断新发呼吸道病毒。 WGS 能够更好地识别感染传播事件和暴发流行,而这在亚基因组测序中并不总是可能的。

翻译:跳跃人生

原文来源: Zhang N, Wang L, Deng X, Liang R, Su M, He C, Hu L, Su Y, Ren J, Yu F, Du L, Jiang S.   Recent advances in the detection of respiratory virus infection in humans . J Med Virol. 2020 Jan 15. doi: 10.1002/jmv.25674. [Epub ahead of print] Review.