​ 全球疫情持续,这个方法或许可以解决新冠样本检测燃眉之急
2021-09-23 10:34:02

 

 

 

迪飞医学·科普专栏系列

全球疫情持续,这个方法或许可以解决新冠样本检测燃眉之急

 

2020 1 月开始, COVID-19 新型冠状病毒就已经在全球范围内肆虐了超过一年半的时间。虽然大多数国家已经开始进行疫苗的接种,但是持续的防控策略和对于病毒的长期监测仍然是目前抑制疫情扩散的主要手段 [1,2,3]

 

此外,在新冠大流行中病毒发生多种变异,这些变异的新冠病毒使得世界上确诊新冠肺炎的人数逐渐攀升,死亡人数也不断增加。据悉,单日确诊的新冠肺炎的病例数已经超过了 75 万。对于新冠病毒分子检测目前还有很大的缺口,这就导致一些国家只能对临床上高度怀疑的患者进行检测,从而给全球疾病的防控带来了巨大的挑战。本文将介绍如何使用 Chelex 100 法( Bio-Rad Laboratories )来解决样品测试过程中试剂短缺的问题。

 

目前在临床诊断中检测 SARS-CoV-2 的标准方法是定量逆转录 PCRRT-qPCR ),但是 RNA 提取试剂盒的限制性导致了该关键提取方法应用的范围十分有限 [4] 。当前的提取试剂盒大多基于离心 / 真空柱( Qiagen) 或磁珠( Thermo Fisher Scientific) 方法。这些方法操作步骤繁琐,速度慢,通量低,需要多种耗材,并且,在必须对大量样品进行手动处理时会导致操作人员的疲劳。以上因素都极大限制了核酸检测的处理速度和检出周期。

 

使用自动化解决方案可以解决其中一些问题,但随之而来的是设备购置成本和 RNA 样本提取成本的大大增加。研究人员一直在努力寻找更好的方法来提高检测速度并降低检测成本,例如,将样品中的病毒灭活后直接用于 RT-qPCR ,这种方法虽然简单方便,但会导致检测的灵敏度较低,并且这种方法的稳定性会也受到环境和样品等因素的影响 [5,6,7]

 

近期,越来越多的研究人员意识到了 Chelex 100 树脂的优势,不但可以弥补 RNA 提取试剂盒的缺点,同时还不受环境和样本来源限制,操作更加简便且成本较低。

 

简单、快速且经济高效的 DNA/RNA 制备

 

1 Chelex 100 树脂是一种热稳定的珠状聚合物,对二价阳离子(如 Mg 2+   等)具有非常高的亲和力。这一特性可用于抑制需要二价离子才能发挥活性的核酸酶,从而实现 DNA/RNA 的提取和检测。实际上, Chelex 100 应用于法医检测中 DNA 的提取已经很久了。

 

2 Chelex 100 法提取核酸非常简单快速。首先,将 Chelex 100 悬浮液添加到样品中,混合并加热(至 70°C 98°C )以促进细胞裂解,并通过离心或自然沉降将 Chelex 100 与剩余样品分离。上清液中即含有所需的 DNA RNA 。此方法可在 210 分钟内制备完成核酸样本。

 

3 Chelex 100 树脂方法能够大大降低成本。在一项研究中比较了各种 DNA 提取方法的成本, Chelex 100 方法与 Qiagen DNA 提取试剂盒相比,成本效益提高了大约 170 [8] 。而 RNA 提取试剂盒的成本更高, Chelex 100 的成本优势更加明显。

 

 

鉴于上述优点, Chelex 100 法越来越受到研究者的喜爱。智利公共卫生研究所的研究人员表明,「通过将 Chelex 100 树脂与较低廉的试剂结合进行核酸沉淀,可以从 covid-19 患者的鼻拭子样本中直接提取 RNA 而无需使用 RNA 提取试剂盒,并且对于不同来源或者不同运输方式的样品都具有同样的的灵敏度、特异性和准确性。该方法提取的 RNA 和使用 Bio Merieux 自动化 NucliSENS easyMAG 系统提取 RNA 时获得的结果一致」 [9]

 

美国国家眼科研究所的研究人员将基于 Chelex 100 树脂的样品制备方法与 RT-qPCR RT-ddPCR 的各种方法进行了比较 [10] Chelex 100 存在下的热处理后,显著提高了检测灵敏度。 Chelex 100 方法检测灵敏度几乎可以接近 100% 的病毒粒子,而传统方法( Qiagen RNeasy )只能检测到 30%50% 的病毒粒子。作者证明了使用 Chelex 100 方法最低检测限度可以达到 1 cps/ µ l 。此外,使用 Chelex 100 树脂和 DMSO 缓冲液收集患者样本可以使检测灵敏度达到最佳。

 

基于 Chelex 100 的样品制备也同时应用于 qPCR 以外的 covid-19 快速检测方法中,如等温扩增法( RT-LAMP )。 RT-LAMP 在操作上不像 RT-qPCR 那样复杂,只需要单一温度进行扩增,并且可以在普通的 PCR 仪器或者加热模块上进行。虽然 RT-LAMP 的灵敏度稍低于 RT-qPCR ,但 RT-LAMP 检测速度快,对环境及设备要求不高,可以作为一种简便快速的筛查方法来使用。

 

加州理工学院的研究人员建立了基于 RT-LAMP SARS-CoV-2 诊断方法,该方法依赖于 Chelex100 法进行样品制备 [11,12] 。该方法从样本收集(唾液或拭子)到出具检测结果只需要 45 分钟,且结果与 RT-qPCR 对照结果一致。

 

另一项研究中,英国研究人员使用便宜的痰液消化剂处理唾液,然后在无核酸酶水或 Chelex100 树脂悬浮液中进行样品制备。与无核酸酶水相比, Chelex 100 树脂存在能够使检测 SARS-CoV-2 的速度大约增加 20%30% 。重要的是, Chelex 100 在一系列样品稀释度范围内实现了更可靠的检测,并克服唾液引起的干扰。

 

基于唾液的 RT-LAMP 方法如果进行高通量采集和检测,将更加有利于社群的大规模筛查。唾液也可由被检测人员自行采集, Chelex 100 树脂安全无害且不需要冷藏,它可以包含在唾液的自收集工具包中。并且 Chelex 100 方法对操作人员更加安全,其样品处理过程的第一步即为高温加热,病毒随即被灭活,减少操作人员的感染风险。

 

Chelex 100 方法是一种非常具有吸引力的可替代传统试剂盒的 DNA/RNA 提取方法,非常适合诊断和检测。 Chelex 100 树脂可以简化工作流程并降低成本,这些优势使其不仅适用于 Covid-19 检测,也适用于包括大多数病原微生物,环境样品,以及较难裂解提取的核酸样品,适用于其他传染病的常规诊断检测。

 

注:

1. 本产品仅限科研使用,不作为临床诊断。

2. Bio-Rad Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标。

 

内容审核:周育红 潘成

 

References

[1]. Scudellari M. How the pandemic might play out in 2021 and beyond. Nature. 2020;584(7819):22-25. doi: 10.1038/d41586-020-02278-5.

[2]. Centers for Disease Control and Prevention. COVID-19 Testing Overview. Updated February 23, 2021. Available at: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/symptoms-testing/testing.html. Accessed February 23, 2021.

[3]. United Nations. COVID-19: Testing still vital even as vaccines roll out. UN News. November 27, 2020. Available at: https://news.un.org/en/story/2020/11/107867. Accessed February 23, 2021.

[4]. Charumilind S, Craven M, Lamb J, Sabow A, Wilson M. When will the COVID-19 pandemic end? McKinsey & Company. January 20, 2021. Available at: https://www.mckinsey.com/industries/healthcare-systems-and-services/our-insights/when-will-the-covid-19-pandemic-end. Accessed February 23, 2021.

[5]. Fomsgaard AS, Rosenstierne MW. An alternative workflow for molecular detection of SARS-CoV-2 - escape from the NA extraction kit-shortage, Copenhagen, Denmark, March 2020. Euro Surveill.2020;25(14):2000398. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.14.2000398.

[6]. Merindol N, Pepin G, Marchand C, et al. SARS-CoV-2 detection by direct rRT-PCR without RNA extraction. J Clin Virol. 2020;128:104423. doi: 10.1016/j.jcv.2020.104423.

[7]. Smyriaki I, Ekman M, Lentini A, et al. Massive and rapid COVID-19 testing is feasible by extraction-free SARS-CoV-2 RT-PCR. Nat Commun.   2020;11(1):4812. doi: 10.1038/s41467-020-18611-5.

[8]. Lienhard A, Schaffer S. Extracting the invisible: obtaining high quality DNA is a challenging task in small arthropods. PeerJ. 2019; 7:e6753. doi: 10.7717/peerj.6753.

[9]. Ulloa S, Bravo C, Parra B, Ramirez E, Acevedo A, Fasce R, Fernandez J. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit.   J Virol Methods.2020;285:113960. doi: 10.1016/j.jviromet.2020.113960.

[10]. Guan B, Frank KM, Maldonado JO, et al. Sensitive extraction-free SARS-CoV-2 RNA virus detection using a novel RNA preparation method.   medRxiv. Epub. February 1, 2021. doi: 10.1101/2021.01.29.21250790.

[11]. Flynn MJ, Snitser O, Flynn J, et al. A simple direct RT-LAMP SARS-CoV-2 saliva diagnostic. medRxiv.Epub. November 22, 2020. doi: 10.1101/2020.11.19.20234948.

[12]. Howson ELA, Kidd SP, Armson B, et al. Preliminary optimisation of a simplified sample preparation method to permit direct detection of SARS-CoV-2 within saliva samples using reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J Virol Methods. 2021;289:114048. doi: 10.1016/j.jviromet.2020.114048.

 

来源:   丁香学术