一文读懂新冠病毒的检测方法
2021-08-21 11:07:51

 

 

 

迪飞医学·科普专栏系列

一文读懂新冠病毒的检测方法


我们今天要讲的是Covid-19新冠病毒的检测方法。经过几个月的科普大家都知道了,Covid-19是一种RNA病毒,这是一种小到我们无法用肉眼或者是显微镜观察到的微生物,那么医学上又是如何将这种微小的病毒检测出来的呢?从检测的目的来说,分为两大类:核酸检测和抗体检测;
核酸检测
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通过直接检测人体的样本里面是否含有新冠病毒的核酸来判定受检者是否感染,这种方法学检测的是新冠病毒本身的特殊基因片段,用一个时态来表达就是感染进行时。目前医学上面常见方法就是我们现在经常听到的核酸检测(荧光定量PCR),为什么说常见呢因为还有一种方法叫做基因测序,这种牛逼的方法需要更加高级的设备和高级的技师操作,一般单位玩不起,目前科研用途大于临床筛查用途,并不作为临床上的常规检测手段。所以,今天也就不展开做介绍啦。我们今天还是主要讲核酸检测和抗体检测。

核酸检测的目标

敌人-新冠病毒的基因片段。作为一个人类从来没有见过的敌人来说,我们之前对于新冠是不了解的,就像是警察要抓一个案子的凶手,我们首先要先根据线索破案。破案以后,我们知道是新冠这个病毒犯罪集团干的坏事,这个集团能隐藏到世界上任何地方,能潜入不同人的身体,所以,第一时间,我们查到凶手以后,就要将凶手的具体特征公布于世,这些特征中最重要的就是它的基因序列!当然还有其他的一些信息,比如病毒感染以后的人体反应,生理变化等等。PCR作为一种直接的检测手段,检测的就是新冠病毒特异的独有的核酸序列;

方法学

PCR英文全称Polymerase chain reaction,中文的名称叫:聚合酶链式反应;这种方法不仅仅用于新冠的检测,也广泛的应用在其他的病毒检测和微生物检测,生物学,考古,刑侦等领域;这种方法学简单的解释就是我们首先采取可疑的样本----56度水浴灭活30分钟--提取核酸--将病毒RNA逆转录为cDNA---用针对特定核酸序列(靶基因)的引物进行扩增放大--所有扩增出来的DNA都会和用荧光标记好的探针进行结合--靶基因量越大被引物引发的扩增量也就越大,和荧光探针结合的量也就越多,如果没有新冠的靶基因出现或者量很少则荧光不出现或者检测不出来--最后通过机器对荧光信号的检测,我们就能知道这个样本里面有没有我们要检测的靶基因--也就是新冠病毒了。图片张大部分人都看不懂的图   
上面那段,我估计大部分人没看懂,在这里请允许我打个比方。经过我们警察的努力,我们终于抓捕了新冠这个嫌疑犯,但是我们又怎么用证据证明,这个嫌疑犯就是我们要找的犯罪份子呢?警察也不能办冤假错案,凡事都得讲证据对吧。于是,我们的警察对这个嫌疑人展开了一个特殊的检测方法;首先我们已经知道了这个犯罪份子的有别于其他任何犯罪份子的重要特征,就是它的集团内有一类特别喜欢吃超级变态辣火锅的头领,这类头领在集团内是一个极其特殊的存在,世界上独一无二,因此他们常常觉得很孤独,这些头领的特性被我们的公安机关研究得很透彻,我们知道他喜欢什么,于是公安人员制造出了一类针对这种首领的卧底,也就是(扩增引物),这个卧底下去以后,马上就认出了这个为非作歹的首领,并假装和首领成为好兄弟,大家一起去吃超级变态辣的火锅,当然只有2个人手拉手去吃火锅的话,我们的警察会因为目标小不好跟踪,我们的卧底很聪明,将这种大家手牵手吃变态辣火锅的方式不断复制出去,于是吃变态火锅的人从只有2个变成了成千上万个;但是虽然数量上去了,但是在茫茫人海中还是不明显,为了能快速的检测出敌人的数量,我们警方派出另外一批穿着特殊荧光服的卧底2去找我们卧底1号的好基友,找到以后,他们3个人就手拉着手一起吃火锅,这样,我们可怜的新冠头领就这样被锁定下来了,警方用监控看一下有多少个闪着特殊荧光的卧底2号,就能反向推断出有多少的为非作歹的坏人(新冠病毒),而且为了准确性,警方往往会放置两类不同的卧底,做双重认证,有的针对变态辣的火锅,有的针对爱爬树的,只有两个卧底都锁定这个集团的时候,才能证明这个是新冠;所以说,搞PCR,有点像是搞无间道。。。图片

核酸检测方法的标本

咽拭子、鼻拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等,极少采用血液;

影响结果的因素

1)采样不标准,采样前吃饭/喝水/刷牙等;(2)试剂本身的灵敏度不高,试剂保管不当失效;(3)操作人员操作不合规;标本被污染,标本没有及时检测等原因;(4)实验室条件不合格;

结果解释

如果核酸检测阳性+临床症状(有些无症状) 可以确诊为新冠感染,但是阴性并不代表没有感染新冠,也不能判断患者没有感染的标准,还需同时结合CT+抗体检测+重复核酸检测来联合判定;如果没有临床症状,阴性也仅仅是代表在你在采集样本的时候,是没有被感染的;

优点

目前诊断新冠确诊感染的“金标准”之一,适用于早期诊断,具有灵敏度和特异性高的特点;

缺点

检测成本相对较高,检测周期较长,从采样到最后出结果一般1个工作日,检测环节相对复杂,对实验室人员的要求较高;

抗体检测
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说完了核酸检测,我们再来说说抗体检测,也就是新冠感染人体的间接证据!用个通俗的说法来说当人体受到新冠的侵袭之后,我们的免疫系统就行动起来,大概5-7天左右就抽调了一个应急的特种部队(IgM抗体)去抵抗新冠,这个特种部队是应急措施,等到免疫系统认真分析应敌策略以后,这个应急措施就会解散,这个时间大约是3周,也就是感染后21天左右这个部队就会消失;然后同时在感染后的2周左右,另外一种对敌的大部队(IgG抗体)正式产生,并将长时间之内存在于人体。我们通过检测这种两种特殊的抗敌部队(IgMIgG抗体)的方法来反向证明是否有对应性的敌人(抗原)入侵,在医学上就称之为抗体检测,这种抗体检测又分为定性和定量两种,用时态来说主要是证明病毒感染的过去时,当然也有可能是进行时(早期检测出IgM的话)。
我们首先来看图,在新冠感染后,人体产生抗体产生的时间,检测周期和核酸检测的对比图:图片目前针对于新冠抗体检测,临床上常用的有3种:分别是胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法,化学发光免疫分析,其中以化学发光免疫的灵敏度和特异性最高,但是这种方法学需要配备高级的免疫发光设备,在非洲不发达的国家,这种设备只有少数几个大医院才会有。以上3种检测抗体的方法虽然名字不同,但是主要的原理是一样的,就是针对抗原和抗体特异结合的方法,来找对方;打个简单的比方:敌人入侵了,我方血液中的抗体部队出动了,我方警察用另外一种标记过新冠特异性的抗原和血液中的抗体结合,有的时候还要和核酸检测一样再加个发光的小帽子,然后再通过检测,就能知道了血液中是否存在这种抗体啦;所以几种抗体检测之间的差异,是标记物之间和检测设备之前的差异,是灵敏度和特异性的差异,从目前的情况来看免疫发光优于酶联免疫吸附法,后者优于胶体金免疫层析法;
下面我们分别简单的来说一下这几种检测方法:

1

胶体金免疫层析法


也就是现在华人圈里有人在卖的这种新冠抗体快速检测试剂,号称可以居家检测,和验怀孕(快速检测试剂条)一样简单的新冠抗体快速检测试剂。这种检测试剂目前有3种,一种是只检测IgM, 一种是同一个试剂条上同时检测IgMIgG,还有一种是分开两个试剂条,分别检测IgMIgG。这3种试剂条的方法学在名字上写得很清楚啦,胶体金免疫层析法。我大概解释一下,胶体金--是一种特定的标志物,就像是我们上面说的荧光一样,我的化学学得不好,胶体金具体的化学解释我就不说了,有兴趣的朋友自己google一下;检测抗体,一般是用双抗原夹心或者是间接法,总之是利用抗原+抗体这种一个钥匙配一把特定的锁的方式将要检测的抗体进行胶体金的标记,简单的比方就是警察知道抗体这种特种部队有一个特点,只要遇到新冠抗原就会结合上去无差别攻击,所以我们就提前在试剂条上放好胶体金标记过的抗原去结合抗体,然后另外一端再用标记过的抗体去进行拦截,如果有的话就能显色啦,很简单。 检测抗原的方法则去标记抗体就可以。这个方法在1971年发明,现在已经在多领域进行了广泛的利用;比如大家熟知的怀孕快检试剂。。。还有大家不熟悉的HIV快检试剂。。
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临床用途

根据中国国家药监局网站上的信息:以上所说的胶体金新冠抗体快检试剂仅用作对新型冠状病毒核酸检测阴性疑似病例的补充检测指标或疑似病例诊断中与核酸检测协同使用,仅限医疗机构使用。

胶体金方法的优点

(1)使用方便快速,便于基层使用和现场使用,所有反应能在15分钟内完成;(2)成本低,不需要特殊的仪器设备;(3)操作简单,普通的操作人员就可以操作;(4) 血清样本采取比核酸检测的标本采取更加容易;也同时降低医护人员在采样中的被感染风险;(5)标记物稳定,试剂易于保存;(6)和核酸试剂联合使用,提高病毒携带者的阳性检出率,对临床有重要的提示作用。在核酸阴性的时候,加上抗体的检测是很有必要的,可以弥补核酸检测漏诊或者错诊等问题;

缺点

1)不能作为新型冠状病毒感染的肺炎确诊和排除的依据;(2)此方法一般只为定性,只能告诉你阳性还是阴性,但是没有数量;(3)胶体金的定性方法在特异性,灵敏度上还是要低于其他两种方法的;
4)因为抗体的个体差异性,会导致可能已经感染,但却检测不到抗体的情况;



2

酶联免疫吸附法(ELISA


和上面胶体金方法的主要区别就是标记物和固相载体的不同而已,ELISA是酶免疫测定技术中应用最广的技术。 其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体( 聚苯乙烯微量反应板) 表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除。 常用的ELISA 法有双抗体夹心法和间接法,前者用于检测大分子抗原,后者用于测定特异抗体。图片
ELISA的方法相较于胶体金的方法,检测的复杂程度上去了,需要用到仪器了,灵敏度和准确度相对而言也是更高了,也能够做半定量分析了;相较于胶体金在基层医院都能做的情况而言,ELISA对实验室的条件和设备提出了更高的要求;

3

免疫发光分析法


听起来就很高级对吧,哈哈。 这种方法学原理其实也不难,和前面两者相比只是标记方式的不同以及提升了灵敏度。相较于前面两者免疫发光具有特异性强、线性范围宽、结果稳定等特点,广泛应用于临床标本的检测,比如我们经常说到的各种激素的检测,各种抗原,抗体等微量蛋白的检测。这种方法其实在中国已经逐步的取代ELISA,但是没有取代胶体金,毕竟胶体金很多筛查准确率已经很高,而且又便宜又方便。但是免疫发光对设备、操作、使用环境的要求比较高,使用时需要配套化学发光仪器,一般这种仪器都是不开放的,也就是说买哪个品牌的仪器就得用他家的指定试剂。国际上的大品牌厂家有罗氏、雅培、西门子等;图片
以上这三种方法都是抗体检测(间接证据),目前并不能成为新冠病毒检测的确诊指标,但是正如上方所说和核酸试剂联合使用,提高病毒携带者的阳性检出率,对临床有重要的提示作用。在核酸阴性的时候,加上抗体的检测是很有必要的,可以弥补核酸检测漏诊或者错诊等问题;以后的一个应用场景有可能会在注射疫苗前后的一个必要的检测;
最后用两张图来总结一下今天的重点:1:新冠病毒检测方法学优缺点一览表图片

方法

优点

缺点

适用

核酸检测

早期诊断,灵敏度和特异性高

专用实验室,人员要求高,费用高,检测时间长,采样不易

金标准,疑似病人确诊

胶体金免疫法

方便,快,便宜,无需设备,取样方便

不能早期诊断,灵敏度和特异性比其他方法要低一些

快速检测,配合核酸使用

化学发光分析法

灵敏度和特异性高,高通量,稳定,人为误差小,采样方便

目前不能成为确诊依据,需要专业设备,要求高,费用高

有条件的医院配套核酸检测

酶联免疫吸附法

比胶体金有更好的表现,但是需要上设备,并且此方法学逐渐被化学发光取代


2:新冠病毒不同检测结果解读图片

PCR

IgM

IgG

结果解释/临床意义

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全阴性,无感染,也有可能是感染的潜伏期

+

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感染早期1-7天,尚未产生任何抗体

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+

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感染中期7-12天左右

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可能是感染的中期,重新检查PCR

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+

全阳性,感染急性期,但是出现了IgG,可能预后良好

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既往感染,现在已经治愈,或者是假阳性

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+

感染急性期已经过去,并出现抗体,可能预后良好

+

-

+

感染超过14天,或者也有可能是重复感染






QA




Q:我能自己在家做核酸或者抗体检测吗?A:核酸检测和免疫发光等自己在家做完全不可能,胶体金检测理论上也是不可以自己在家检测或者是用手指血的(除非该试剂有相关的医疗注册证)。如果你是在海外,把胶体金的方法作为一种应急补充方案,那也不是不行,但是千万不要把这个作为确诊依据,一次检测阴性不代表你没有感染,也有可能没有产生抗体,或者没有检测出来;千万不要因此觉得没事,就不去医院做核酸检测了,反而耽误病情!
Q:怎么样提高核酸标本的“含金量”?A:核酸样本常用的样本是咽拭子、鼻拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液等,我们普通人去检测一般是前面几样,因此采样前切记哈,别清洗,如果是咽拭子,别喝水,别吃东西,别刷牙。。。剩下的就是医生的事情啦~
Q:去医院检测怕被传染。。。A:这个可能性不是没有哈,大家去之前肯定是全副武装,回来以后,立刻换下你的全部武装,该消毒的消毒,该洗掉的衣服洗掉。最重要的是触摸过医院的设施以后,立刻马上消毒!消毒!不止你的手,重要的还有你的手机!还有包包这些可能携带病毒源的物品,务必认真消毒。
Q:核酸检测阴性,但是有临床症状?A:建议同时检查抗体和CT,并且去不同医院复查核酸,样本方面如果有痰液最好用痰液,特别是清晨的那种。。。Q:核酸检测做一次就可以了吗?A:不是的,核酸检测的结果只代表你取样时的状态。后面出现临床变化的时候需要重新采样。
Q:为什么每种方法学都没有100%的准确性?A:在医学检验上来说,检验的结果是受到多方的影响的,采样的情况,个体免疫情况,试剂、仪器、操作方式,方法学本身都会对结果产生影响,因此目前没有哪种方法学敢说是100%的准确性。所以说,核酸和抗体的联合检测会帮助提升阳性检出率,这是好事情,有条件的可以配套起来做。
Q:用英语怎么表达要同时做新冠核酸检测和抗体检测?ACan I do the test of Covid 19 nucleic acid and IgM&IgG antibody?
好啦,今天我这个不专业的,各种比喻的检验知识就和大家分享到这里,非专业探讨,仅供参考。我希望我的老师们不要跳出来打我。如果大家还有疑问的话,可以在文后留言,我和我背后的强大的检验专业人士会尽量帮助大家回答。

​本文来源:波布非洲